Паклитаксел

Введение

В условиях современной жизни онкологические заболевания остаются одной из самых глобальных проблем человечества. Рак входит в десятку ведущих причин смерти людей по всему миру, причем в странах с высоким уровнем дохода онкологические заболевания уступают первенство только заболеваниям сердечно-сосудистой системы. По оценкам Международного агентства по изучению рака (IARC) Всемирной организации здравоохранения, в 2008 г было зарегистрировано 12,7 млн новых случаев заболевания раком, показатели смертности от различных новообразований составили 7,6 млн человек (около 13% от всех смертей). На данный период времени, согласно статистике, от заболевания страдает 14 миллионов пациентов, из них 8,2 миллиона больных погибнут. К 2030 г глобальное бремя, как ожидается, вырастет до 21,4 млн новых случаев онкологических заболеваний и 13,2 млн случаев смерти от рака.

Поиск путей, лекарственных средств и препаратов, способных помочь в борьбе с раковыми заболеваниями, ведется достаточно широко во всем мире. Одними из хорошо зарекомендовавших себя и широко применяемых в клинической практике противоопухолевых агентов являются таксаны – вторичные метаболиты растений семейства Тиссовых (Taxaceae), к которым относится паклитаксел, алкалоид растений рода Taxus.

Растущая потребность в паклитакселе, с одной стороны, и ограниченность существующей базы его производства, с другой, стимулировали исследования по разработке альтернативной технологии производства − в культуре клеток растений, поскольку растения в культуре in vitro способны к синтезу тех же метаболитов, что присущи интактному растению. Поэтому актуальны исследования и разработки, направленные на получение новых штаммов-продуцентов паклитаксела, отработку технологий культивирования клеток в биореакторах и внедрению их в промышленность для получения противоопухолевых препаратов.

Число раковых заболеваний, лечение которых возможно с помощью паклитаксела, постоянно расширяется. В различных исследованиях показаны свойства паклитаксела как эффективного антилейкемического и противоопухолевого агента в отношении немелкоклеточного рака легкого (терапия больных, которым не планируется проведение хирургического лечения и/или лучевой терапии), плоскоклеточного рака головы и шеи, переходноклеточного рака мочевого пузыря, рака пищевода, лейкемии, печени, а также во второй линии лечения саркомы Капоши, развившейся у больных СПИД. Обнадеживающие результаты были получены и при лечении рака кожи и толстой кишки.

В настоящее время есть сведения, что препарат тестируется для лечения нераковых заболеваний, которые требуют стабилизации микротрубочек и предотвращения клеточной пролиферации и ангиогенеза, например, псориаза. Кроме того, возможно применение паклитаксела для лечения таупатий (поражений тау-белков), таких как болезнь Альцгеймера или Паркинсона, в частности, кодируемых на хромосоме.

В настоящее время паклитаксел, в коммерческом масштабе производится в основном полусинтетически из баккатина III, выделяемого из хвои дикорастущих или культивируемых видов европейского или гималайского тиса. Однако это не позволило радикально решить указанную выше проблему обеспечения производства паклитаксела натуральным сырьем, которым в данном случае является баккатин III, так как его содержание в хвое деревьев все же не столь высоко – 0,1 % по сухому весу. Более 3 т хвои должно быть собрано, измельчено, экстрагировано, целевые продукты выделены, прореагированы и очищены, чтобы получить 1 кг конечного продукта.

Данный растительный материал подвержен значительным вариациям по содержанию таксоида из-за эпигенетических и экологических факторов. Также имеется ограничение вследствие медленного роста самих растений. Кроме того, производство существенно удорожается за счет сложной очистки целевого продукта от сопутствующих таксоидов. В США паклитаксел производится химическим способом, который также сложен и дорог.

Суспензионные клеточные культуры наподобие других микроорганизмов рассматриваются как наиболее приспособленная и желательная форма для крупномасштабных операций.

В настоящее время паклитаксел является одним из наиболее успешных противоопухолевых препаратов, разработанных за последние 50 лет. Препарат является мировым лидером по объему продаж среди лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.

Исследования

Материалом для исследований служили каллусные культуры, полученные нами в 2015 г из побегов хвои интактного растения Taxus.

Получены несколько каллусных и суспензионных линий клеток Taxus. Линии соответствуют по накоплению биомассы хорошо растущим культурам, но характеризуются значительными колебания роста от пассажа к пассажу.
Подобраны питательные среды и условия культивирования, позволяющие сохранить рост клеточных культур на длительный период времени.
Был разработан высокочувствительный и селективный способ определения паклитаксела в биомассе клеток Taxus, который позволил проводить количественное определение аналита, начиная с уровня следовых количеств, методом ВЭЖХ. Имеется разработанная Методика.
Определено содержание паклитаксела во всех полученных линиях, установлено, что оно колеблется от пассажа к пассажу и во всех вариантах значительно уступает интактному растению.
На основе полученных данных для дальнейших работ по получению штамма выбрана одна суспензионная линия, обладающая наиболее высокими и стабильными параметрами роста и биосинтеза.
Начаты исследования динамики роста и биосинтеза в суспензионной культуре T.
Продолжается изучение влияния элиситора на рост и биосинтез суспензионной культуры T.
Проводится изучение влияния посевной дозы на накопление биомассы паклитаксела суспензионной культурой тисса за цикл выращивания.
Показано, что в суспензионной культуре T. baccata в питательную среду выделяется от Х до Y от общего содержания паклитаксела в биомассе и среде. Динамика и взаимосвязь накопления внутри и внеклеточного паклитаксела в суспензионной культуре требует дальнейшего изучения.
В 2017 году изучение культуры клеток тисса проводили по трем направлениям.

Первое – анализ ростовых и биосинтетических характеристик суспензионной культуры при длительном пассировании в стандартных условиях, которые были определены предыдущими исследованиями (отчет 2016).

Второе – изучение возможности максимальной стандартизации условий культивирования и прежде всего способа пересева суспензии.

Третье – изучение влияния компонентов питательной среды: гормонов, аминокислот, витаминов, микроэлементов, минеральных солей и элиситоров на накопление биомассы и биосинтез паклитаксела в суспензионной культуре клеток тисса.

Выводы

Результаты проделанной нами работы за период 2015-2017 гг. позволяют сделать следующие заключения:

Суспензионная культура клеток тисса при пассировании в течение более полутора лет сохраняет ростовые и биосинтетические способности. Тенденции к снижению роста и биосинтеза при длительном пассировании не прослеживается, можно говорить о стабильности культуры в определенных пределах. Обе характеристики колеблются от пассажа к пассажу. По накоплению сухой биомассы эти колебания находятся в основном в пределах Х (достигая в отдельных случаях значений от Х г/л). Содержание паклитаксела в основном колеблется от 0.1 – 0.4 мг/100 г биомассы.
По накоплению биомассы суспензионная культура тиса превосходит описанные отечественные культуры и соответствует культурам со средней ростовой активностью.
По содержанию паклитаксела в биомассе, полученная нами линия только в отдельных случаях приближается к пригодным для коммерческого использования культурам тиса.

Показано, что стандартизация процесса пересева методом взвешивания инокулята не приводит к стабилизации характеристик культуры, но вызывает постепенное снижение ее ростовой активности.
Изучен рост и биосинтез суспензионной культуры тиса на средах с различным содержанием аминокислот, тиамина, минеральных солей и микроэлементов. Показано, что в случае увеличения концентрации в среде одного из веществ возрастает как ростовая, так и биосинтетическая активность культуры.
Внесение в среду еще одного важного вещества в определенной опытным путем концентрации позволяет значительно (в 4,5-7 раз) увеличить содержание в биомассе паклитаксела, а также повышает ростовую активность.
Показано, что добавление в среду элиситора позволяет при незначительном снижении роста увеличить накопление паклитаксела – в 4 раза. Однако этот эффект проявляется только при достаточно высокой биосинтетической активности культуры в определенной фазе роста.
Плантационное размножение и сбор растений тисса требует больших затрат земельных площадей, времени и труда.

Ограничение природных источников растительного сырья, таких как кора и другие органы тисса, стимулировали работы по созданию иных, более приемлемых источников паклитаксела.

Использование интактных растений в биотехнологических производствах имеет общие недостатки:

– невозможность обеспечить экологическую чистоту производства растительной биомассы;
– получение растительной биомассы с заданными характеристиками зависит от сезона, климатических и погодных условий;
– низкая скорость прироста биомассы;
– возможное присутствие в биомассе пестицидов, гербицидов, радиоактивных соединений и других поллютантов;
– как правило, низкое содержание целевого продукта в интактном растении.

Крупномасштабное промышленное производство ценных метаболитов из клеточных культур растений возможно только суспензионным способом. В связи с этим как только нами были селектированы удовлетворительно растущие каллусные культуры Taxus, началась работа по получению суспензионных клеточных линий.

Биотехнологические процессы производства паклитаксела в суспензионных культурах клеток тисса разных видов разрабатываются и патентуются в ряде стран мира с использованием объемов от нескольких миллилитров (колбы) до десятков тысяч литров (биореактор типа ферментатора вместимостью до 75 м3).

В России получено несколько линий клеток T. cuspidata. В некоторых странах уже получены и широко исследуются каллусные и суспензионные культуры клеток тисса [данные литературы]. Максимально достигнутая продуктивность культуры составила до 1,1 мг/(л•сутки), что соответствует минимальной экономически эффективной величине, приемлемой для коммерческого производства. Однако коммерческое применение растительных клеточных культур для производства паклитаксела еще ограничено низким выходом конечного продукта и высокой стоимостью производства.

Многочисленные исследования культуры тиса, проводимые в различных лабораториях мира, показали, что этот объект – один из наиболее сложных для введения в культуру, оптимизации роста клеток и образования ими таксоидов. Данные об отечественных штаммах тисса со стабильными характеристиками отсутствуют.

Производство продукта методами биотехнологии (в культуре клеток растений) радикально решает проблему дефицита исходного сырья. При развитии производства в нашей стране можно решить проблему импортозамещения и организовать экспорт продукции. Для обеспечения своей экономической независимости Россия не может не быть заинтересованной в создании собственного производства такого необходимого и ценного препарата, как паклитаксел.

Его отечественное производство должно осуществляться биотехнологическим способом, причем в культуре клеток того вида тисса, который произрастает в этой стране. Однако принципиально важно наличие исходного штамма клеток-продуцентов вещества. Получение исходного штамма весьма трудоемко и требует довольно долгого времени (порядка нескольких лет).

Полученная нами суспензионная культура тисса обладает при пассировании в течение более полутора лет стабильными в определенных пределах ростовыми и биосинтетическими показателями. Ростовые характеристики культуры удовлетворительны, а биосинтетические в основном ниже требуемых для практического использования.

На основе полученных данных составлен паспорт на суспензионную культуру тиса и штамм депонирован в БРЦ ВКПМ.

Задача дальнейшего исследования – это прежде всего изучение динамики накопления паклитаксела в цикле роста, с целью определения времени максимального содержания его в биомассе, и оптимизации продолжительности цикла выращивания. Необходимо продолжение работ по оптимизации и стандартизации условий пересева. Полученные данные показали перспективность продолжения работ по оптимизации гормонального состава среды.

На данный момент нами не найдено ни одного коммерческого штамма-продуцента паклитаксела в РФ.